與競爭法相比小分子免疫檢測夾心法的優勢在哪里？
藥物、環境污染物、化學污染物等小分子物質的檢測是臨床診斷、環境監測、食品分析等領域的重要課題。幾十年來，免疫檢測作為一種敏感、直接、經濟的測量分析系統，一直是目標分析物可量化測量的支柱。免疫檢測通常分為兩大類，競爭法和非競爭法，非競爭法中最常用的就是夾心法。競爭免疫檢測與夾心免疫檢測，兩者在檢測原理、分析性能上有著本質性差異。在競爭免疫檢測中，分析物與標記的（或固定的）分析物競爭有限的特異性抗體。相反，夾心免疫檢測可以結合基于過量存在的兩種不同抗體的分析物，賦予更高水平的靈敏度、精度和特異性。
1.檢測原理差異
競爭免疫檢測原理
在競爭免疫測定中，通常只采用一株抗體，且反應體系中抗體數量相對于待測物質數量是有限或不足的。示蹤劑通過標記目標分析物的類似物進行制備，示蹤劑與樣本中的待測物共同競爭有限數量的抗體結合位點，被捕獲示蹤劑的數量與樣本中分析物的濃度成反比關系。
夾心免疫檢測原理
在夾心免疫測定中，通常采用兩株抗體，可與分析物形成“三明治夾心”結構。其中一株抗體被固定在固相載體上，用于從樣本中捕獲分析物，另一株抗體特異性識別分析物的另一位點，用于構建信號生成系統，產生檢測信號。產生的信號強度與樣本中分析物濃度存在一定的正比關系。
表1.夾心與競爭免疫檢測的原理差異
| 檢測方法 | 夾心法 | 競爭法 |
| 試劑用量 | 試劑過量 | 試劑限量 |
| 抗體株數 | 識別位點不同的兩株抗體 | 一株抗體 |
| 信號強度 | 與分析物濃度成正比 | 與分析物濃度成反比 |
| 信號響應 |
|
|
| 檢測結果 | 反映被分析物占用 的抗體結合位點數量 |
反映未被分析物占用 的抗體結合位點數量 |
競爭法靈敏度主要取決于抗體的結合能力（平衡常數），夾心法靈敏度受平衡常數的影響較低，靈敏度主要取決于分析物存在時的信號增益幅度和分析物不存在時的測量誤差。從信號響應曲線來看，夾心法與競爭法產生鉤狀效應的位置不同，夾心法鉤狀效應發生在抗體高劑量時，競爭法則發生在抗體低劑量時。一般來說，在低背景下測量強信號要比測量兩個弱信號之間的差異容易得多。基于這個原因，夾心法理論上具備比競爭法更高的靈敏度。此外，在動力學方面過量使用捕獲和示蹤抗體，有利于抗體-抗原-抗體復合物的形成，從而提高敏感性。
2.小分子免疫檢測夾心法優勢的實踐研究
中國農業大學研究團隊在開展小分子夾心免疫檢測中分析物最小表位距離的研究中，比較了夾心和競爭免疫檢測對不同表位距離模式分析物的檢出限（LOD）、檢測范圍及特異性。發現在合適的抗原表位間距下，盡可能避免抗體空間位阻，這時夾心免疫檢測比競爭免疫檢測具有更高的靈敏度和更寬的檢測范圍，更適合用于小分子的測定。
2.1小分子夾心與競爭免疫檢測的初步比較
2.1.1目標分析物
研究團隊首先選擇了兩個典型的半抗原表位三聚氰胺（MEL）和對硝基苯胺（NIA），并用不同長度的線性鏈連接子（1-14個亞甲基）來模擬表位距離，創建了9個模型分析物，并將其命名為MN1-MN9。此外，為了評估這兩種免疫分析格式的特異性，在MN3的NIA端添加了一個甲基，合成了一種新的結構類似物。模型分析物及用于產生檢測抗體的半抗原化學結構見圖1。
圖1.模型分析物和半抗原的化學結構
注：（a）表位距離從2.4到19.0?（a圖下部分）不同的MEL和NIA（a圖上部分）組成的9種模型分析物示意圖。（b）不同間隔臂長度的MEL半抗原的化學結構。半抗原M1（n=1），半抗原M2（n=3），半抗原M3（n=5），半抗原M4（n=7），半抗原M5（n=9），半抗原M6（n=11）。（c）不同間隔臂長度的NIA半抗原的化學結構。半抗原N1（n=0），半抗原N2（n=2），半抗原N3（n=4），半抗原N4（n=6），半抗原N5（n=8），半抗原N6（n=10）。
表2.模型分析物分子量和表位距離
| 模型分析物 | 分子量（Da） | 表位距離（?） |
|---|---|---|
| MN1 | 304 | 2.4 |
| MN2 | 318 | 3.8 |
| MN3 | 332 | 4.9 |
| MN4 | 346 | 6.3 |
| MN5 | 374 | 8.8 |
| MN6 | 402 | 11.3 |
| MN7 | 430 | 13.9 |
| MN8 | 458 | 16.4 |
| MN9 | 486 | 19.0 |
2.1.2夾心和競爭免疫檢測的比較
研究團隊選擇了半抗原MEL（M4）的單克隆抗體7A3和半抗原NIA（N4）的單克隆抗體17B3，對模型分析物MN1-MN9及MN3類似物進行夾心和競爭免疫檢測。比較了夾心免疫檢測和競爭免疫檢測的LOD、檢測范圍和特異性。在合適的表位距離下（11.6-19.0?），小分子夾心免疫檢測具有更高的靈敏度和檢測范圍。MN6-MN9夾心免疫檢測的LOD非常低（0.00035-0.9nM），檢測范圍比競爭法（LOD為0.001-38.8nM）更寬。MN3類似物的競爭免疫檢測靈敏度與MN3相當，而夾心免疫檢測并不識別MN3類似物，表明夾心免疫檢測對目標分析物具有高特異性。
圖2.模型分析物夾心和競爭免疫檢測的校準曲線
注：（a）基于單克隆抗體（mAb）7A3的競爭免疫檢測對MEL、MN1-MN9和類似物的校準曲線（n=3）。（b）基于mAb 17B3的競爭免疫檢測對NIA、MN1-MN9和類似物的校準曲線（n=3）。（c）以mAb 7A3為捕獲抗體、mAb 17B3為檢測抗體對MN1-MN9、MEL、NIA和類似物的夾心免疫檢測的校準曲線（n=3）。
表3.MN模型分析物夾心與競爭免疫檢測的檢測限和線性范圍
| 模型分析物 | 檢測限（nM） | 檢測范圍（nM） | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 7A3+17B3 | 7A3 | 17B3 | 7A3+17B3 | 7A3 | 17B3 | |
| MN1 | 29944 | 0.2 | 0.6 | 57425-532076 | 10.3-304.2 | 2.1-133.3 |
| MN2 | 21402 | 0.5 | 0.5 | 41759-410439 | 2.7-174.2 | 1.2-106.9 |
| MN3 | 19202 | 0.9 | 0.17 | 38546-392930 | 1.9-21.8 | 5.3-270.5 |
| MN4 | 15335 | 0.7 | 0.02 | 34444-547784 | 1.5-16.5 | 0.07-3.5 |
| MN5 | 265.4 | 0.08 | 0.03 | 504.1-4516.8 | 0.3-14.6 | 0.09-3.1 |
| MN6 | 0.002 | 0.004 | 0.6 | 0.019-123.5 | 0.02-10.1 | 1.8-84.3 |
| MN7 | 0.00035 | 0.001 | 0.7 | 0.0034-220.3 | 0.004-0.33 | 1.5-428.0 |
| MN8 | 0.0094 | 0.4 | 1.7 | 0.078-106.7 | 1.9-47.8 | 5.0-4686 |
| MN9 | 0.9 | 38.8 | 33.7 | 16.2-35399 | 134-9535 | 98.1-3805 |
| 類似物 | / | 0.6 | 0.3 | / | 1.3-16.9 | 1.8-896.1 |
注：夾心和競爭免疫檢測的檢出限（LOD）定義為使ODmax（IC10）降低10%的分析物濃度。在IC20和IC80之間建立檢測范圍。/代表陰性結果。
2.2小分子夾心免疫檢測優勢的進一步驗證
為了驗證“合適的抗原表位間距下，夾心免疫檢測比競爭免疫檢測具有更高的靈敏度和更寬的檢測范圍。”這一結論。研究團隊構建了一組新的模型分析物，進一步比較了夾心免疫檢測和競爭免疫檢測的LOD、檢測范圍和特異性，結果與初步研究結果一致。
2.2.1目標分析物
使用廣泛用于人類和獸醫診所的典型抗菌劑磺胺芐胺（SBA）和諾氟沙星（NOR），合成了兩種新的模型分析物SBA-C2-NOR和SBA-C10-NOR。
表4.模型分析物分子量和表位距離
| 模型分析物 | 分子量（Da） | 表位距離（?） |
|---|---|---|
| SBA?C2?NOR | 679 | 3.8 |
| SBA?C10?NOR | 791 | 13.9 |
2.2.2夾心免疫檢測的優勢驗證
用半抗原SBA的單克隆抗體4D11和半抗原NOR的單克隆抗體N2H3A8，對模型分析物SBA?C2?NOR和SBA-C10-NOR進行測定。結果顯示，與競爭免疫檢測相比，夾心免疫檢測對SBA-C10-NOR（抗原表位距離為13.9?）的敏感性、檢測范圍和特異性方面，具有明顯的優勢，其中LOD較競爭法提高了近30倍。
圖3.模型分析物夾心和競爭免疫檢測的校準曲線
表5.模型分析物夾心與競爭免疫檢測的檢測限和線性范圍
| 模型分析物 | 檢測限（nM） | 檢測范圍（nM） | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 4D11+N2H3A8a | 4D11b | N2H3A8c | 4D11+N2H3A8a | 4D11b | N2H3A8c | |
| SBA?C2?NOR | 0.3 | 0.53 | 0.13 | 0.89-37.43 | 1.18-18.64 | 0.30-4.80 |
| SBA?C10?NOR | 0.02 | 0.61 | 0.21 | 0.33-48.22 | 1.38-22.58 | 0.47-7.30 |
a.基于4D11和N2H3A8抗體的夾心免疫檢測結果。
b.基于4D11抗體的競爭免疫檢測結果。
c.基于N2H3A8抗體的競爭免疫檢測結果。
夾心免疫檢測在小分子檢測中的主導作用，很大程度上取決于目標分析物的結構和最佳抗體對。兩個抗體識別分析物的表位距離適當時，會避免抗體空間位阻，此時夾心法比競爭法免疫檢測具有更高的靈敏度和更寬的檢測范圍，更適合用于小分子測定。
參考文獻
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